化妝品的刺激性是消費者們在購買產(chǎn)品時最為關(guān)注的方面之一，畢竟大家都希望在使用化妝品后能改善皮膚狀態(tài)而不是“爛臉”。
我國的法規(guī)對這一方面也十分重視，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015版）》中“毒理學(xué)試驗方法”部分對化妝品原料及其產(chǎn)品安全性評價的毒理學(xué)檢測做出規(guī)定，要求化妝品新原料需進行刺激性實驗。刺激性實驗包括皮膚和急性眼刺激性/腐蝕性實驗，《規(guī)范》中所規(guī)定的兩種實驗均為在體動物實驗。
但近年來，以歐盟為首的全球眾多國家和地區(qū)正呼吁禁止在化妝品安全評價中使用動物實驗，這使得開發(fā)替代動物實驗的體外化妝品刺激性評價方法成為未來的趨勢。目前，歐洲替代方法驗證中心（ECVAM, European Centre for the Validation of Alternative Methods）已經(jīng)驗證了多種滿足動物實驗3R原則的化妝品體外皮膚/眼球刺激性的評價方法。
眼球刺激性/腐蝕性評價
1 牛角膜透明度和透氣性試驗（BCOP）
BCOP法是利用離體牛角膜與受試物直接接觸，若受試物具有刺激性則會導(dǎo)致牛角膜上皮屏障功能破損和基質(zhì)蛋白變性。
該方法將牛角膜的透明度和透氣性作為毒理學(xué)的評價指標，根據(jù)公式計算與兩個指標數(shù)值相關(guān)的體外刺激分數(shù)（In Vitro Irritancy Score，IVIS），通過評分進行分類：若IVIS > 55，則受試物具有嚴重眼刺激性；若IVIS ≤ 3，則無刺激性；若3＜IVIS ≤ 55，則無法判斷，需結(jié)合其他替代方法進一步測試。
BCOP法可用于分辨眼刺激性的有無，但無法準確區(qū)分輕微、中等刺激，且無法區(qū)分嚴重眼刺激與眼損傷，該方法不受樣品劑型、溶解性的限制。
2 離體雞眼試驗（ICE）
ICE法是利用短期離體培養(yǎng)的雞眼球進行眼刺激性試驗的方法。
取雞眼球固定于夾持器，暴露受試物，通過肉眼檢查、測量角膜厚度、表面灌流和熒光素滲透，將角膜渾濁度、角膜膨脹度和熒光素滯留度的數(shù)值作為評價指標，分別對三個評價維度進行ICE分類，每個維度包括I、II、III、IV四個等級，最后通過三個評價指標的終點組合分析：若終點組合為3×I或2×I+1×II，則無刺激性；若終點組合為3×IV、2×IV+1×Ⅲ、2×IV+1×II、2×IV+1×IV、30 min時角膜渾濁度≥3（至少兩只眼球）、任何時間點角膜渾濁度= 4（至少2只眼球）、上皮嚴重松弛（至少1只眼球），則有嚴重眼損傷和眼腐蝕；若為其他情況，則無法判斷。
ICE法可用于鑒別化學(xué)物的眼腐蝕和嚴重眼損傷或無刺激性，但無法區(qū)分嚴重眼刺激、眼損傷。該方法適用于固體、液體、乳劑、凝膠狀化合物。
3 短期暴露試驗（STE）
STE法利用兔眼角膜細胞（SIRC），將受試物短期暴露5min，使用MTT法或CCK-8法測定細胞吸光度，通過計算受試物暴露后引起角膜上皮的細胞生存率判斷受試物的眼刺激性。
若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細胞生存率≤70%，則該受試物有刺激性；反之，若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細胞生存率＞70%，則無眼刺激性。
4 重組人角膜上皮模型試驗（RhCE）
RhCE模型是將來源于正常人的表皮角質(zhì)細胞生長于特殊制備的嵌入式細胞培養(yǎng)板中，通過培養(yǎng)，細胞分化形成多層結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)建與角膜上皮非常相似的三維模型，目前 EpiOcularTMEIT是唯一已獲得OECD指南驗證的標準模型。
受試物暴露于類似角膜上皮模型一定時間后，使用MTT法計算細胞吸光度，通過計算受試物暴露后引起角膜上皮的細胞生存率判斷受試物的眼刺激性。若細胞存活率＞60%，則無刺激；若存活率≤ 60%，代表有刺激，但無法區(qū)分嚴重眼損傷或眼刺激，也無法對眼刺激進一步分類，此時需要使用其他方法進一步判斷。
5 雞胚絨毛-尿囊膜試驗（HET-CAM）
9日齡雞胚（CAM）開始試驗。用牙科彎鑷小心剝?nèi)馐业皻げ糠郑诘皻つけ砻娴螏椎紊睇}水使充分潤濕，傾出后，用鑷子小心除去蛋殼膜，保證暴露的尿素膜完整不受任何損傷。取0.3mL/0.3g受試物直接作用于CAM。盡量涂布開，確保覆蓋面積達到至少50%。作用3min后，用純水輕輕沖洗CAM表面，在30s內(nèi)沖洗完成，傾出液體，立即在體視鏡下觀察每種毒性效應(yīng)變化程度，給予評分（ES）。
若ES≤12，則評價為無眼刺激性或輕度眼刺激性；若12＜ES＜16，則評價為中度眼刺激性；若ES≥16，則評價為嚴重眼刺激性。
該方法適用于多種類型液體原料和產(chǎn)品，對固體、不溶性、黏稠性物質(zhì)的重復(fù)性差，慎用于色素和染料的測試，主要適用于無刺激到輕度刺激物的預(yù)測。
皮膚刺激性/腐蝕性評價
1 重組人表皮模型試驗（RHE）
RHE試驗是通過培養(yǎng)未分化的人體表皮角質(zhì)形成細胞，重組三維人體表皮的模型。
常見的皮膚刺激性評價模型有EpiSkin、EpiDermTM、SkinEthicTM、LabCyte EPI-MODEL24 SIT；皮膚腐蝕性評價模型有EpiskinTM、EpiDermTMSCT、SkinEthinTMRHE和epiCS。
該方法將受試物直接與模型接觸一定的時間后，使用MTT法測試細胞毒性，不同的模型有其相應(yīng)的判斷指標。
下面對其中一種皮膚腐蝕性的EpiskinTM模型進行介紹。該模型主要通過細胞存活率進行判斷：當受試物暴露3min 后，若細胞存活率<35%，則有腐蝕性，腐蝕性強度為1A；若暴露3 min后，存活率≥35%且暴露60 min后，存活率＜35%，則有腐蝕性，腐蝕性強度為1B和1C；若暴露240min后，存活率≥35%，則無腐蝕性。該方法不僅可用于鑒別物質(zhì)是否具有腐蝕性，且可以對腐蝕性強度 1A、1B和1C 進一步分類，但無法區(qū)分1B、1C。受試物可以為固態(tài)、半固態(tài)、液體和蠟狀。
2 體外經(jīng)皮電阻試驗（TER）
將待測的化學(xué)物質(zhì)暴露于離體的大鼠皮膚表面，具有腐蝕性的受試物可破壞表皮角質(zhì)層，使通過皮片的電阻值（TER）明顯降低。若經(jīng)皮電阻值＞5 kΩ，則受試物無腐蝕性；若經(jīng)皮電阻≤5 kΩ，而且該受試物不是表面活性物質(zhì)或中性有機溶劑，評定受試物具有腐蝕性；如果受試物為表面活性物質(zhì)或中性有機溶劑，經(jīng)皮電阻≤5 kΩ，可增加硫丹明B染色劑穿透試驗，以確定是否出現(xiàn)假陽性。
TER試驗與人體皮膚模型試驗相比具有簡便、經(jīng)濟和對試驗條件要求不苛刻的優(yōu)點。
最后，用表格對上述知識點再進行一次總結(jié)，要多多復(fù)習(xí)。
*本文所用圖片均來自網(wǎng)絡(luò)
參考文獻
轉(zhuǎn)載自：藥大妝研
我們的服務(wù)：
| 研發(fā)服務(wù) | 體外功效評價 |
• 為功效原料改良及開發(fā)提供技術(shù)支持 • 為產(chǎn)品配方改良及開發(fā)提供技術(shù)支持 • 研發(fā)咨詢服務(wù) |
聯(lián)系我們
快速導(dǎo)航
關(guān)注我們