皮膚衰老的指標有哪些
皮膚衰老的特征標志物：細胞形態變大，扁平，細胞核體積增大；衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）酶活性增強；p53、p21和p16表達上調；Lamin B1下調；ATM表達下調；穩定的DNA損傷反應（DDR）；HMGB1核移位至細胞質和細胞外液；衰老相關分泌表型（SASP）的分泌，包括基質金屬蛋白酶（MMPs）和炎癥因子（IL-1, IL-6, IL-8等）；以及脂褐質和ROS的大量積累等……
衰老相關分泌表型（SASP）是衰老細胞分泌的一種促炎癥表型。SASP包括一系列細胞因子和生長因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β、趨化因子、基質金屬蛋白酶等。這些因子通過與免疫系統協作，改善細胞微環境的同時，影響鄰近細胞的增殖與分化。多種轉錄因子和信號通路參與SASP的調控。例如，NF-κB、p53、p21、p16和Rb等單獨或協同激活SASP；ATM、CHK2、ATR、GATA4和聚合酶1（PARP1）等DNA損傷反應（DDR）蛋白也參與SASP的調節網絡。
圖1 皮膚衰老相關影響因素及作用機制[1,2]
圖2 皮膚衰老相關生物指標[3]
1.基于人皮膚角質形成細胞的抗衰功效測定
角質形成細胞數量占表皮細胞的80%以上，是表皮的主要構成細胞。在向角質細胞轉化的過程中，角質形成細胞可分為四個層次，分別是基底層、棘層、顆粒層和角質層。表皮中紫外線敏感的靶細胞主要是角質形成細胞。近年來，眾多研究表明，人角質形成細胞在光老化的起始與演進過程中扮演著舉足輕重的角色，并且在加劇炎癥反應方面表現得尤為顯著。
紫外線照射可誘導角質形成細胞釋放超量自由基。在磷脂酶A2作用下，自由基誘發花生四烯酸的產生，花生四烯酸在環氧化酶與脂質環氧化酶作用下，合成初級炎癥因子，如白三烯（LTB4）和前列腺素E2（PGE2）。自由基還通過上調核轉錄酶NF-kB，促進DNA表達更多的次級炎癥因子，如腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-1。此外，紫外線照射還可以激活細胞內NF-kB、MAPK信號傳導通路，誘導IL-6、COX-2等促炎因子表達。
炎癥因子（IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1 α等）
圖3 不同處理條件下炎癥因子含量變化
人永生化角質形成細胞來源于非黑色素瘤的人體正常表皮組織，可以在培養條件下無限期地進行增殖，不會發生自然凋亡。目前，HaCaT細胞已廣泛應用于美白保濕、抗衰、劃痕實驗等多項體外功效檢測項目中。
2.基于人皮膚表皮干細胞的抗衰功效測定
表皮干細胞（Epidermal stem cells，EpiSCs）位于表皮基底層，通過整合素附著在下方基底膜上，具有自我更新的能力，并分化為各層皮膚組織。表皮一直處于不斷增殖、分化和凋亡的狀態。中波紫外線（UVB）的誘變性很強，與DNA相互作用產生胸腺嘧啶二聚體光產物，導致DNA損傷；UVB穿透性強，可滲透到表皮基底層。
圖4 表皮干細胞及紫外線對其影響
表皮干細胞是各種表皮細胞的祖先細胞，具有雙向分化的能力。它們主要存在于表皮基底層中，是維持皮膚穩態和修復機制的關鍵。表皮干細胞的干性表達主要體現在其自我更新和多向分化潛能上，這使得它們能夠不斷產生新的表皮細胞，維持皮膚完整性和功能性。表皮干細胞的干性表達對皮膚抗衰具有重要作用。它們通過促進皮膚修復和再生、維持皮膚彈性和緊致度、調節皮膚炎癥反應和免疫系統功能以及促進皮膚細胞代謝等方式來減緩皮膚衰老。因此，保護和促進表皮干細胞的干性表達對于維持皮膚健康和年輕態具有重要意義。
圖5 細胞干性表達
3.基于人皮膚成纖維細胞的抗衰功效測定
人皮膚成纖維細胞（Human skin fibroblasts，HSF）主要位于真皮層，在乳頭層和網狀層中均有分布。成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來。這些細胞具有合成和分泌多種細胞外基質成分的能力，包括膠原蛋白、彈性蛋白、透明質酸和糖蛋白等。HSF的減少是皺紋產生的關鍵因素。
當皮膚受到損傷時，表皮干細胞會被激活并遷移到傷口處，分化成新的表皮細胞以修復受損組織；通過分泌生長因子和細胞因子等活性物質，刺激皮膚成纖維細胞合成膠原蛋白和彈性蛋白等結構蛋白，使皮膚更加緊致光滑；通過分泌消炎因子等活性物質來減少炎癥反應的發生和持續，保護皮膚免受外界損傷和刺激，從而減緩皮膚衰老；促進皮膚細胞代謝，包括細胞分裂、增殖和分化等。
研究人員已明確指出，自然老化過程中皮膚膠原的減少，歸因于成纖維細胞合成膠原的能力減弱，同時伴隨基質金屬蛋白酶（特別是MMP-1和MMP-2）分泌增多。相比之下，光老化導致的皮膚膠原減少，則主要由于成纖維細胞分泌的基質金屬蛋白酶顯著增加，而膠原合成的降低并不如前者顯著。由此可見，在自然老化和光老化這兩種皮膚老化過程中，成纖維細胞的膠原代謝機制存在著一定的差異。
圖7 Collagen I and Elastin含量
圖8 Collagen I and Elastin表達
4.其他衰老相關生物指標的測定
衰老細胞通常體積增大，溶酶體衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）酶活性增高。β-半乳糖苷酶在正常人體細胞中主要表達在溶酶體，最適pH為4-4.5；而在衰老細胞中，SA-β-gal大量積累，最適pH偏移至6，因此給予β-gal作用底物X-gal和pH6的環境，衰老細胞可在β-gal的作用下，將底物轉變為深藍色，在普通光學顯微鏡下可觀測。
β-半乳糖苷酶染色圖
圖9 β-半乳糖苷酶染色圖
線粒體功能障礙可能是引發衰老的始動因素之一，除了線粒體膜電位下降外，還包括線粒體質量、形態的異常變化。這些變化會導致細胞能量代謝受損、細胞功能障礙甚至死亡，從而加速細胞衰老。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質（matrix）中，形成聚合物（J-aggregates），可產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體（monomer），可產生綠色熒光。
圖10線粒體膜電位圖
超過80%的面部老化由紫外照射所致，同時皮膚衰老阻礙了自噬的發生。自噬是衰老過程的關鍵參與者，增加自噬可延緩衰老。采用MDC作為熒光探針來標記和觀察細胞自噬體。
圖11 細胞自噬通量
丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應的產物之一。在細胞衰老過程中，由于活性氧自由基（ROS）的累積和抗氧化機制的失衡，會導致膜脂發生過氧化反應，從而產生丙二醛。這種過氧化反應會損害生物膜及其功能，導致細胞結構和功能的改變，進而加速細胞衰老。TBA法測定MDA含量，MDA在酸性和高溫條件下，與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成棕紅色三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），532 nm處比色測定樣品中過氧化脂質含量。
圖12 細胞內MDA含量
細胞衰老最基本的特征之一，就是發生不可逆轉的細胞周期停滯，可能是由有害刺激或異常增殖引起的警報反應。隨著細胞衰老進程的推進，細胞周期相關因子p16、p21、p53表達上調，并在衰老細胞中積累，從而導致細胞周期停滯。通過qPCR或免疫熒光手段檢測p16、p21、p53表達情況，以評價樣品的抗光老化作用。
圖13 細胞衰老相關基因表達（p16, p21, p53）
5.抗氧化功效評價
抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，DPPH的氮原子孤對電子/PITO的氧原子孤對電子可與自由基清除劑提供一個電子配對，自身紫紅色/藍紫色變淺，吸光度變化程度與自由基清除程度呈線性關系。因此可通過吸光度變化進行定量分析，從而評價樣品的自由基清除能力。
DPPH / PTIO自由基清除實驗(生化反應)
圖14 DPPH / PTIO自由基清除實驗（生化反應）
機體新陳代謝及外界環境刺激（如UV、環境污染、化學試劑等）可能導致自由基的產生，自由基具有較強的氧化能力，當自身疾病或外界刺激過強導致自由基產生增加，而自身抗氧化能力不足以完全消除氧化物，過量自由基導致細胞結構和功能的破壞，以及機體組織損傷和器官病變。因此，采用UVB刺激人永生化角質形成細胞（HaCaT），通過檢測樣品作用后HaCaT細胞內活性氧（ROS）含量變化，評價樣品的抗氧化功效。
圖15 ROS含量（DCFH-DA法）
6.抗糖基化功效評價
糖基化終產物（AGEs）是蛋白質、脂肪和糖類結合在一起產生的非酶促反應終產物。
它們會在人體內積累，并逐漸破壞細胞的結構和功能。AGEs的積累會導致細胞膜流動性降低，影響細胞的物質交流和信號傳遞。隨著AGEs的積累，細胞的功能逐漸喪失。這表現為細胞增殖與分化能力下降，代謝速率減慢，以及對外界刺激的敏感性降低等。細胞功能的喪失會導致組織器官功能下降，進而引發各種疾病和衰老現象。
牛血清白蛋白的游離氨基可與還原糖（果糖）的醛基經過縮合、重排、裂解、氧化修飾反應生成帶有熒光吸收的AGEs，AGEs含量變化一定程度反應待測樣品的抗糖基化活性。CML是由賴氨酸以GO為中間體產生的一種非熒光性、非交聯性AGEs，能引發炎癥和衰老，導致皮膚損傷，可通過ELISA法對其含量進行測定。
圖16 AGEs抑制率和CML含量（ELISA）
上述方法系統性闡述了利用體外細胞培養及模型構建技術來評估抗衰老效果的評價體系。其核心目的在于，針對多樣化的功效評估與測試需求，通過體外培養特定類型的細胞或構建細胞損傷模型，并運用目標活性成分進行刺激處理。隨后，觀察細胞的形態變化、毒性反應及增殖能力等關鍵指標。在此基礎上，進一步運用分子生物學技術，如分析特定基因通路及相關蛋白的表達水平，全面評估原料或成品在抗衰老方面的實際功效。
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